Капиллярное секвенирование, как оно есть

Сайт Наука в Сибири 11 апреля 2018 г.
Сайт Новости Сибирской Науки 12 апреля 2018 г.
Газета Наука в Сибири №18 (3129) от 17 мая 2018 г.

Слова “ген” и “ДНК” слышали, наверное, все, словосочетание “прочитать геном” — почти все. Но как технически расшифровывается информация, спрятанная в ДНК? Кто владеет “генетической азбукой морзе” и что выполняет роль телеграфного ключа? Чтобы ответить на этот вопрос, журналистка “Науки в Сибири” приняла участие в первой научно-практической школе по капиллярному секвенированию ДНК, организованной Институтом молекулярной и клеточной биологии СО РАН, компаниями “Хеликон” и “Thermo Fisher Scientific”.

В наше время секвенирование — то есть прочтение последовательности нуклеотидов (элементарных кирпичиков) ДНК и РНК — рутинный процесс, необходимый для работы большинства биологических лабораторий.

— Капиллярное секвенирование (еще его называют секвенированием по Сэнгеру) — один из самых широко используемых методов расшифровки последовательности ДНК в лабораториях. Он применяется, в тех случаях, когда человеку нужно проанализировать отдельные молекулы ДНК, чаще всего в генной инженерии или в ходе медицинских исследований. Например, при создании генно-инженерных конструкций исследователю важно удостовериться, что в созданной им искусственной молекуле ДНК все работает именно так, как он предполагает. В медицине метод применяется при поиске каких-то конкретных мутаций у пациентов, чтобы убедиться: диагноз поставлен правильно. Соответственно, берут образец ткани или физиологической жидкости этого пациента, выделяют ДНК и прочитывают интересующие их места в геноме, — объяснил заместитель директора Института молекулярной и клеточной биологии СО РАН, заведующий лабораторией геномики ИМКБ СО РАН кандидат биологических наук Степан Белякин.

На школу приехало 15 человек из Институтов СО РАН, НГУ, научных организаций Кемерово, Красноярска, Томска. 

seq_1.JPG

— Мы организовали это мероприятие, в основном, чтобы поделиться нашими опытом, показать, какие проблемы возникают при капиллярном секвенировании и как их решать. Я предполагал, что придут преимущественно люди из соседних институтов, возможно потенциальные заказчики Центра коллективного пользования ИМКБ СО РАН. Однако благодаря активности компании “Хеликон”, выступившей соорганизатором школы, приехали люди еще из других городов. Поскольку у нас большой опыт использования метода секвенирования по Сэнгеру, мы, наверное, можем утверждать, что с основными проблемами уже успели столкнуться и как-то их или решить, или развести руками. Этому и были посвящены лекции сотрудников нашего института, а два доклада представителей компании Thermo Fisher Scientific: затрагивали стандартные вещи — устройство секвенатора, его настройку и использование, пробоподготовку, — добавил Степан Белякин.

При секвенировании по Сэнгеру фрагмент ДНК, который нужно прочитать, сначала внедряется в плазмиду (кольцевая ДНК у бактерий), затем бактерии, размножаясь, “штампуют” множество копий исходного фрагмента, после чего многократно скопированные участки ДНК выделяют из микроорганизмов и добавляют в смесь для секвенирующей реакции. А уже в этой смеси начинается самое интересное — исходный фрагмент снова много раз тиражируется, но уже не полностью, а “обрывками”, длина которых может различаться, как минимум, на один нуклеотид. Множить фрагмент помогает ДНК-полимераза, синтез начинается с “затравки” — праймера, а “обрывает” кусочки ДНК терминатор — нуклеотид, обладающий свойством прекращать синтез цепи ДНК. Каждый терминатор несет на себе флуоресцентную метку, которая позволяет однозначно определить его “имя” — A (аденин), T (тимин), G (гуанин) или C (цитозин).

Чтобы наконец-то прочитать нуклеотидную последовательность исходного фрагмента, “обрывки” ДНК дифференцируются по длине с помощью электрофореза — перемещения частиц в геле под действием электрического поля. Когда на отрицательно заряженную молекулу ДНК действует электрическое поле, она двигается по капилляру секвенатора, заполненному гелем, к положительному полюсу.

seq_2.JPG

Капилляры представляют собой тонкие трубочки, диаметр которых меньше сечения человеческого волоса, они состоят из сверхчистого кремния и окружены металлической оболочкой. Известно, что в плотном геле короткие “кусочки” ДНК “проходят” быстрее, чем длинные. Соответственно, их можно ранжировать по длине, а разрешающая способность равна одному нуклеотиду.

Когда “кусочки” ДНК “добегают” до положительного полюса капилляра, на фотографической матрице секвенатора определяется цвет нуклеотида-терминатора по его флуоресцентной метке. Таким образом, можно определить последовательность нуклеотидов исходного фрагмента — например, если короткий кусочек ДНК из двух нуклеотидов маркирован буквой Т, то значит на втором месте последовательности ДНК тоже стоит нуклеотид тимин и так далее.

Участникам школы предстояло самим приготовить реакционную смесь (фрагмент ДНК для прочтения последовательности был предоставлен уже готовый), провести секвенирующую реакцию в амплификаторе — приборе, который многократно (на протяжении 35 циклов) нагревает и охлаждает смесь в течение двух часов для того, чтобы в ней произошло образование “обрывочков” ДНК, а затем очистить продукты реакции и загрузить их в секвенатор.

На взгляд неопытного человека, самое сложное в приготовлении реакционной смеси — правильно пользоваться автоматической пипеткой. Поскольку компоненты измерялись в микролитрах, (1 мкл — 1/1000 миллилитра), очень сложно было заметить, набран ли необходимый реагент, на глаз это определить практически невозможно.

seq_3.JPG

Затем, после двухчасового циклического нагревания смеси в амплификаторе, проводилась очистка продуктов реакции от неотработавших праймеров. После чего участники познакомились с восьмиканальным (восьмикаппилярным) секвенатором, производительность которого — до 1000 пар нуклеотидов за один цикл работы прибора, а загрузить единовременно можно восемь образцов. На аналогичных машинах был впервые, в течение 13 лет, прочитан геном человека. Сейчас, конечно, расшифровка таких больших объемов информации производится методом полногеномного секвенирования, а не капиллярного.

seq_4.JPG

Надо отметить, первые секвенаторы были не только громоздки и медлительны, но и даже опасны для здоровья — терминаторы помечались не флуоресцентной, а радиоактивной меткой. Современный же прибор занимает не больше места, чем средних размеров копировальный аппарат. Более того, всю работу по определению последовательности нуклеотидов, секвенатор выполняет сам и в качестве результата выгружает последовательность ДНК и таблицу с графиками, похожими на кардиограммы — на ней визуализированы цветом разные нуклеотиды, а каждая буква (“имя” нуклеотида) выглядит на графике, как пик. После получения результата участникам школы предстояло оценить качество последовательности по интенсивности пиков и другим параметрам.

seq_5.JPG

К сожалению, отсутствие навыков работы с автоматической пипеткой не прошло даром — корреспонденту “Науки в Сибири” “прочитать” ДНК не удалось. Зато у всех остальных участников получилось отлично. Завершилась школа обзором бесплатного программного обеспечения для анализа данных и современных решений для секвенирования.

Надежда Дмитриева
Фото автора

PDF-файл статьи